假陰性問題沒那么簡單

國家衛(wèi)建委：結(jié)果陰性也可能感染

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2月21日，國家衛(wèi)健委印發(fā)《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》，在實驗室檢測技術(shù)指南中明確指出，核酸檢測結(jié)果陰性不能排除新冠病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素。

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具體因素包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確保存、運輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

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近日在廣東省人民政府新聞辦公室舉行發(fā)布會上，國家衛(wèi)健委高級別專家組組長、中國工程院院士鐘南山也表示，用核酸檢測確診是正確的，但還要看取材，絕大多數(shù)采樣是取鼻和咽，如果采樣不準(zhǔn)確，會造成很大的結(jié)果差異。

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同時鐘南山還表示，核酸檢測的準(zhǔn)確性并沒有媒體說的那么低。之前有媒體報道稱，核酸檢測的準(zhǔn)確率只有30%-50%左右，有的甚至說只有20%-30%，其實核酸檢測應(yīng)該是比較準(zhǔn)確的。

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核酸檢測準(zhǔn)確率不會這么低，但國內(nèi)也確有患者檢測4次都是陰性，第5次才是陽性的情況。

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2月8日，浙江青田縣新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控工作指揮部發(fā)布公告稱，51歲男性患者章某某，2月1日起連續(xù)4次核酸檢測均為陰性，2月7日第5次核酸檢測呈陽性，確診為新型冠狀病毒感染的肺炎病例。

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1月30日《人民日報》報道，天津一例新型冠狀病毒患者在1月25日、1月28日共進(jìn)行3次核酸檢測，都為陰性，但是在1月30日的第四次檢測中呈陽性。

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檢測四五次才能確診，這些真的是因為新型冠狀病毒太狡猾嗎？

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核酸檢測是金標(biāo)準(zhǔn)，沒有疑問

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想知道為什么出現(xiàn)假陰性，就要知道核酸檢測試劑盒如何檢測新冠病毒。

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根據(jù)國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心介紹，新型冠狀病毒與2003年的SARS冠狀病毒一樣，由RNA核酸和蛋白等組成。RNA核酸由四種不同堿基排列而成，不同病毒的核酸堿基排列方式，就像發(fā)報的密電碼，各有不同。

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因此可以通過采集人的特定部位細(xì)胞樣本，檢測其中是否含有病毒RNA核酸，確認(rèn)機體是否受到感染。

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核酸檢測就像分析密電碼，新型冠狀病毒也有其特異的密電碼，但與其它冠狀病毒也有相似性，根據(jù)2月19日國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》，目前研究顯示，新型冠狀病毒與蝙蝠SARS樣冠狀病毒同源性達(dá)85%以上。

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新型冠狀病毒的RNA核酸約有3萬個堿基，不同區(qū)域和其它冠狀病毒的相似性有所不同，有些區(qū)域相似度高達(dá)90%以上，因此核酸檢測試劑選擇相似度低的區(qū)域進(jìn)行，這樣就可以特異地識別新型冠狀病毒。

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就像同一地區(qū)身份證號有幾位數(shù)字相同，那么就通過其他區(qū)域的數(shù)字對個人進(jìn)行區(qū)分。

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進(jìn)行區(qū)域識別后，如果核酸檢測結(jié)果為陽性，即證明新冠病毒特有的RNA核酸存在，即感染新冠病毒。通常我們說病毒核酸檢測是確診感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，這個“金標(biāo)準(zhǔn)”就是指“陽性”結(jié)果。

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近期有部分一線醫(yī)生和業(yè)內(nèi)人士建議將CT也作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，但嚴(yán)格來講，CT的準(zhǔn)確性比不上核酸檢驗，更無法替代核酸檢測。

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近日中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會主任委員王成彬發(fā)布文章表示，核酸檢測從方法學(xué)層面考慮其作為實驗室診斷金標(biāo)準(zhǔn)沒有任何疑問。

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CT作為臨床影像學(xué)篩查指標(biāo)具有重要價值，但無論從早期診斷、鑒別診斷、排除診斷還是最終確診等方面都還具有一定的局限性，更無法替代病原學(xué)診斷。

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假陰性的四方面原因

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對核酸檢驗假陰性，不少聲音將原因指向核酸檢測試劑盒，但實際上核酸檢測是一個流程，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都有可能導(dǎo)致假陰性。

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根據(jù)國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心信息，在被感染者中檢出核酸，需同時滿足以下四個條件：

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（1）被感染者的細(xì)胞中有一定量的病毒；

（2）采集標(biāo)本時，必須采集到含有病毒的細(xì)胞；

（3）可靠的體外診斷試劑；

（4） 規(guī)范的臨床核酸檢測實驗室（合理的分區(qū)、有能力的檢測人員和嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系）。

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以上4個條件就是可能導(dǎo)致假陰性的4方面因素。

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患者：可能病毒含量太少

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核算檢測試劑對感染者體內(nèi)的病毒存在量有一定要求，如果病毒含量太少，現(xiàn)有的方法或許檢測不到。

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據(jù)了解，新冠肺炎患者的發(fā)病都會經(jīng)歷一個從感染后無癥狀，到輕度癥狀出現(xiàn)，再到嚴(yán)重癥狀出現(xiàn)的過程。

不同病程、不同病情患者機體中的病毒存在量可能不同，已有病毒感染，但由于在相關(guān)部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于現(xiàn)有方法檢測不到，也稱窗口期。

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王成彬表示，對臨床高度疑似新冠肺炎患者，應(yīng)該連續(xù)采集標(biāo)本進(jìn)行檢測，這可能是臨床患者多次檢測陰性，陽性結(jié)果出現(xiàn)晚的主要原因之一。

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其實任何病原學(xué)檢測，都不能只根據(jù)一次陰性結(jié)果而做出排除性診斷，更不能根據(jù)核酸檢測陰性而漏診臨床高度疑似的新冠肺炎患者，尤其在高發(fā)地區(qū)，在大面積流行期間。

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此外，患者不同部位的病毒存量也不一樣。

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機體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進(jìn)入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進(jìn)而到達(dá)肺泡，不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同，由這些部位細(xì)胞所含病毒受體占比不同所致。

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新型冠狀病毒感染，肺泡上皮細(xì)胞的病毒受體表達(dá)占比最高，氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等則占比極低。

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因此，下呼吸道的病毒量明顯高于上呼吸道，呼吸道病毒檢出可能性又高于血液。肺泡灌洗液中最容易檢出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。

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但是采集肺泡灌洗液的標(biāo)本卻沒有那么簡單。

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標(biāo)本：假陰性無法完全避免

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根據(jù)王成彬表述，很多專家從實踐工作中總結(jié)出的經(jīng)驗認(rèn)為，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液標(biāo)本陽性率高于上呼吸道的口鼻咽拭子采集的標(biāo)本；鼻咽拭子標(biāo)本檢測陽性率又高于口咽拭子。

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口鼻咽拭子這也是這兩天被廣泛評論的某患者咽拭子標(biāo)本三次核酸檢測陰性，收住院后在搶救過程中采集肺泡灌洗液標(biāo)本核酸檢測陽性的原因。

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雖然肺泡灌洗液的陽性率最高，但是操作復(fù)雜，采集難度大，而且容易引起患者噴射，導(dǎo)致采集操作者感染風(fēng)險大，因此難以作為常規(guī)采樣方法，只有部分氣管切開、上呼吸機搶救病人可用。

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此外根據(jù)國家衛(wèi)健委檢驗中心信息，新冠肺炎患者通常為干咳，下呼吸道的痰標(biāo)本也較難得到。

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由于操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床最常用的標(biāo)本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子。

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因此，采集部位不當(dāng)，如采集口咽拭子時，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，采集到的細(xì)胞可能大部分都不含病毒，即可能造成假陰性。

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此外，如果平時醫(yī)護人員咽拭子取樣不多，刮取標(biāo)本時患者的反應(yīng)又比較大，往往導(dǎo)致刮取標(biāo)本的位置不對，或力度和時間不夠，沒有刮取到帶病毒的標(biāo)本或刮取到的帶病毒標(biāo)本量少，最后也會導(dǎo)致檢測結(jié)果陰性。

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對比國家衛(wèi)健委發(fā)布的第四版、第五版和第六版診療方案可以發(fā)現(xiàn)，第五版已經(jīng)將第四版的“咽拭子”改為“鼻咽拭子”。

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第六版又添加內(nèi)容強調(diào)：為提高核酸檢測陽性率，建議盡可能留取痰液，實施氣管插管患者采集下呼吸道分泌物，標(biāo)本采集后盡快送檢。

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采集患者標(biāo)本的重點已經(jīng)越來越偏向下呼吸道，檢驗的陽性率或許也將明顯提高。

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實際上，在樣本中尋找病毒，就像在一本百萬字的書里尋找錯別字，理論上說，即使只有一個錯別字也可以被發(fā)現(xiàn)。

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但實際上，由于成本和時間等的限制，只能從中隨機抽取10萬或者20萬字進(jìn)行查找，如果錯別字?jǐn)?shù)較少，就有可能不在被抽取的字?jǐn)?shù)當(dāng)中，因此無法找到。

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同樣，樣本中病毒數(shù)量低于一定程度，試劑也就無法檢出。因此從這個層面上看，病毒核酸檢測的“假陰性”或許是無法完全避免的。

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檢測試劑：火速獲批，質(zhì)量或參差不齊

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疫情面前，檢測試劑獲批十分迅速。

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1月26日國家藥監(jiān)局發(fā)布消息表示，已應(yīng)急審批通過4家企業(yè)4個新型冠狀病毒檢測產(chǎn)品，包括華大基因新型冠狀病毒檢測試劑盒、華大智造DNBSEQ-T7測序系統(tǒng)獲批、上海捷諾rtpcr、上海之江rtpcr。

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據(jù)了解，國家藥監(jiān)局啟動應(yīng)急審批程序，僅4天就批準(zhǔn)四家公司四個產(chǎn)品，緊急應(yīng)對疫情。目前已有多家械企完成新冠病毒檢測試劑的研發(fā)或者獲得注冊證。

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根據(jù)上市公司公告，達(dá)安基因已獲得新型冠狀病毒（2019-nCoV)核酸檢測試劑盒（熒光 PCR法）的醫(yī)療器械注冊證。

迪安診斷、萬孚生物、美康生物、透景生命等械企都已完成新型冠狀病毒（2019-nCoV）系列檢測試劑新品的研發(fā)，部分已進(jìn)入應(yīng)急審批通道。

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據(jù)不完全統(tǒng)計，目前有超過130家企業(yè)在生產(chǎn)新型冠狀病毒相關(guān)檢測試劑。

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對于這些檢測試劑的質(zhì)量，近日重慶市人民醫(yī)院三院院區(qū)檢驗科發(fā)布《6 種國產(chǎn)新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測性能比較與分析》（下稱《比較與分析》）。

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上述檢驗科醫(yī)務(wù)人員收集院內(nèi)1 例弱陽性患者不同時間點采集的咽拭子標(biāo)本。因為弱陽性樣品往往對試劑盒的靈敏度有較高要求，如果最低檢出限達(dá)不到樣品的檢測濃度，則會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

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根據(jù)《比較與分析》，試驗具體選取了圣湘生物、北京卡尤迪、碩世生物、中元生物、中山達(dá)安和北京卓成惠生的新冠病毒核酸檢測試劑盒，基因檢測類型均為 ORF1ab 和 N 基因兩個靶點。

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最終研究結(jié)果表明，國產(chǎn) 6 種試劑對弱陽性樣品的檢測能力參差不齊，少數(shù)試劑對兩個基因靶點均能檢出，而部分試劑只能檢測出其中一個。

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從試劑方面分析原因，可能與試劑引物設(shè)計有關(guān)，也可能與各位點檢測靈敏度相關(guān)。

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某知名診斷械企相關(guān)負(fù)責(zé)人對賽柏藍(lán)器械表示，檢測試劑靈敏度是個重要因素，因為DNA比RNA穩(wěn)定，所以要先把RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，到一定濃度后，通過試劑中的引物和探針對相應(yīng)基因靶點進(jìn)行檢測。

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每個廠家試劑中引物和探針的靈敏度都有區(qū)別，濃度、純化程度以及試劑中酶、金屬離子等成分與質(zhì)量的差異，都可能影響擴增效率和最后檢測結(jié)果的靈敏度。

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王成彬分析稱，由于本次疫情的特殊和緊迫性，很多廠家研發(fā)試劑來不及完成正常流程，無法得到一定數(shù)量臨床患者標(biāo)本的驗證，只能通過模擬真實標(biāo)本中的病毒進(jìn)行驗證。

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國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心也表示，部分廠家的試劑產(chǎn)品由于研發(fā)時間短，也沒有使用已知臨床樣本進(jìn)行必要的性能確認(rèn)，可能存在對試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題。

實驗室：30家機構(gòu)，符合率100%

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除了檢測試劑本身，實驗室規(guī)范與否也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生重要影響。標(biāo)本運輸保存條件、臨床實驗室的規(guī)范操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量控制等都是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵因素。

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那么我國實驗室的檢測能力如何？

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近日根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會消息，貴州省臨床檢驗中心組織了針對省內(nèi)34家新型冠狀病毒核酸檢測實驗室進(jìn)行技術(shù)考核，考核品一共分10個批次，包括陰性、弱陽性和陽性。

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最終結(jié)果顯示，考核發(fā)放樣品34家，至規(guī)定時間回收結(jié)果30份。在30家檢測機構(gòu)，總符合率為100%。

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其中陽性樣品符合率、陰性樣品符合率、全省疾控系統(tǒng)總符合率、全省醫(yī)療機構(gòu)總符合率、第三方機構(gòu)總符合率均為100%。本次考核，一共涉及6個廠家試劑，其符合率也為100%。

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貴州省臨床試驗中心表示，在回報的30家檢測實驗室中，用于考核樣品檢測的一共為6家產(chǎn)品，并且主要集中在傳統(tǒng)的2家基因試劑廠家上，占87%左右。

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貴州省臨床試驗中心認(rèn)為，對于社會關(guān)注的核酸檢測陽性率低的問題，主要是由病人疾病發(fā)展過程、標(biāo)本采集、標(biāo)本保存與運輸?shù)葐栴}引起。加強與臨床和疾控采樣人員的溝通和聯(lián)系，共同對分析前質(zhì)量進(jìn)行管理，以保障檢驗質(zhì)量，其意義非常重要。

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據(jù)了解，2月21日國家衛(wèi)健委印發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》，同時發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》對標(biāo)本采集、處理、包裝、保存、送檢、檢測以及等實驗室檢測技術(shù)提出詳細(xì)要求。

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例如采集咽拭子時，要求被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次進(jìn)行采集。

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以此規(guī)范標(biāo)本采集等流程操作，盡量避免影響檢驗結(jié)果。

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抗體檢測輔助，降低假陰性率

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綜上所述，核酸檢驗的假陰性有多方面因素，如標(biāo)本中尋找病毒有概率性、不可能所有醫(yī)護人員都操作規(guī)范等，類似這樣的問題一時難以解決，但并不代表沒有其他辦法有效降低假陰性的概率。

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2月15日據(jù)央視新聞報道，在鐘南山院士的指導(dǎo)下，實驗室聯(lián)合多家研究機構(gòu)，最新研發(fā)出新型冠狀病毒IgM抗體快速檢測試劑盒，并已在實驗室和臨床完成初步評價。

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據(jù)介紹，此試劑盒僅需采取一滴血就可在15分鐘內(nèi)肉眼觀察獲得檢測結(jié)果，且患者的血漿稀釋500至1000倍后，仍能檢測出陽性條帶。

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國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心表示，補充新型冠狀病毒特異抗體檢測，這一辦法對降低假陰性率行之有效。

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據(jù)國家藥監(jiān)局器審中心官微介紹，特異性抗體檢測是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過抗原檢測抗體的存在，間接證明人體已感染或曾感染新型冠狀病毒。

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據(jù)了解，檢測的抗體主要分為IgM和IgG兩類。一般IgM抗體在感染早期出現(xiàn)，IgG抗體在感染中晚期出現(xiàn)，滴度有一個持續(xù)增高的過程，并在血液循環(huán)中保持較長時間存在。

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但是要注意，雖然抗體檢測能在一定程度上證明人體感染病毒，但并不能取代核酸檢驗的金標(biāo)準(zhǔn)地位。

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國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心強調(diào)，檢測特異抗體也可以明確患者是否“近期或既往感染過新型冠狀病毒”，有助于核酸檢測陰性但臨床上疑似患者的確診。

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但是特異抗體檢測陽性不能像病毒核酸檢測陽性一樣作為病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因為抗體檢測容易受到血液標(biāo)本中的一些干擾物質(zhì)，如類風(fēng)濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等的存在而出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果。

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與此同時，已有械企完成研發(fā)或取得相關(guān)產(chǎn)品的注冊證。

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2月21日，安圖生物發(fā)布公告稱，近日已取得抗體檢測試劑盒的《醫(yī)療器械注冊證》，具體包括肺炎支原體 IgG 抗體檢測試劑盒、呼吸道合胞病毒IgM 抗體檢測試劑盒、腸 道 病毒 71 型IgM 抗體檢測試劑盒。

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2月20日，萬孚生物發(fā)布公告稱，公司收到國務(wù)院通知，申報的適宜于疫情現(xiàn)場的新型冠狀病毒抗原快速檢測試劑、基于熒光微球/膠體金免疫層析技術(shù)新型冠狀病毒抗體快速檢測試劑，二個項目的產(chǎn)品推薦進(jìn)入應(yīng)急審批通道。

2月21日，邁克生物發(fā)布公告稱，目前公司已完成新型冠狀病毒 IgG 和 IgM 抗體檢測試劑盒（直接化學(xué)發(fā)光法）、新型冠狀病毒（SARS-Cov-2）IgG/IgM 抗體檢測試劑盒（膠體金法）的研發(fā)工作。