引言：感染性疾病診斷市場在IVD行業(yè)一直是最大的細分市場，感染性疾病的診斷技術(shù)也一直在不停發(fā)展，從最早的培養(yǎng)法，到血液學(xué)分析、特定蛋白檢測、免疫學(xué)抗原抗體檢測，再到病原體質(zhì)譜和核酸分析，手段越來越精準，讓人眼花繚亂。如何從眾多技術(shù)中洞察未來發(fā)展趨勢，找準最大的風(fēng)口，請跟隨我一起，來一場感染性疾病診斷技術(shù)的旅行吧！
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人類發(fā)展進程中，感染性疾病一直是嚴重威脅人類健康的重大疾病，歷史上傳染病大爆發(fā)有過多次記載：霍亂、歐洲鼠疫（黑死?。?、西班牙大流感等等，大瘟疫流行期間，最多殺死過1/3人口（歐洲中世紀大瘟疫死亡2500萬人）。
今年年初由新型冠狀病毒引發(fā)的瘟疫，截止目前（2020.3.3）感染人數(shù)超8萬人，死亡超3000人，也會被載入人類史冊。
以往傳染病的大爆發(fā)，因為沒有及時的隔離措施（主要靠事后將尸體焚燒）、有效的傳染病病原體鑒定技術(shù)以及良好醫(yī)學(xué)治療手段的支撐，傳染人數(shù)和死亡數(shù)都非常可怕，現(xiàn)代社會管理體系，在以上三方面都有了長足的進步，從武漢1.23封城到疫情控制，基本只用了1個月，新發(fā)病例急劇減少，這一個月內(nèi)，診斷產(chǎn)品快速研制、藥物快速篩選和試錯，都為瘟疫控制起到了極大的作用。
筆者近十年一直從事體外診斷IVD行業(yè)，現(xiàn)嘗試對感染性疾病的診斷技術(shù)進行一次概括，以期讓大家對感染性疾病診斷有一次全面的了解，因為能力有限，一家之言，肯定偏跛，有興趣的朋友歡迎探討。?感染性疾病目前診斷技術(shù)手段主要有：培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測、核酸檢測、質(zhì)譜法。
1、培養(yǎng)
培養(yǎng)技術(shù)主要是將人體的血液以及其他體液（尿液、胸腹水、痰液、腦脊液、膿液等等）接種到特制培養(yǎng)基或活體上進行微生物培養(yǎng)，一直是感染性疾病診斷的“金標準”，但這個“金標準”因為培養(yǎng)周期長效率低、培養(yǎng)陽性率或成功率有限、容易引入雜菌或定植菌等因素，逐漸受到其他診斷技術(shù)的挑戰(zhàn)，后面會對其他三種臨床上常用的診斷技術(shù)進行分別敘述。
培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展方向，基本就是朝著自動化發(fā)展，自動化培養(yǎng)/接種/劃線、自動化鑒定與藥敏試驗、自動化染色，減少人工操作負擔(dān)和誤差。
這里再補充一點，做微生物顯微鏡檢，目前很多醫(yī)院還在經(jīng)常使用，直接肉眼觀測來判斷。
?2、免疫學(xué)檢測?
免疫學(xué)檢測，主要是利用高特異性的抗原抗體反應(yīng)以及高靈敏度的分子信標來檢測樣本中的待測物。感染性疾病中，病原體侵襲人體，突破機體非特異性的第一道防線和第二道防線后，最終被具有特異性的第三道防線——免疫系統(tǒng)所識別。病原體自身的蛋白、核酸或磷脂等物質(zhì)會刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，同時病原體自身物質(zhì)也會微量殘留在機體內(nèi)，通過檢測病人血樣或其他樣本中的病原體抗體或抗原，來判斷病原體的存在。
近50年來，免疫診斷技術(shù)有了長足的發(fā)展，開發(fā)出了以上圖示常見免疫學(xué)診斷技術(shù)。
目前主流技術(shù)是化學(xué)發(fā)光免疫分析，因其自動化程度高、檢測結(jié)果準確、靈敏度高而受到臨床及檢驗領(lǐng)域的廣泛使用和認可，也是目前IVD行業(yè)最熱門、競爭最激烈、市場份額占比最大、利潤最高的細分市場。
如此眾多的免疫學(xué)檢測技術(shù)，區(qū)別主要在于檢測結(jié)果的準確度和靈敏度。
新興的單分子免疫分析技術(shù)，檢測靈敏度可以達到fg/ml（1fg=10-15g）左右，也在逐漸走入大家的視野。通常來說，一個靈敏度更高的技術(shù)出現(xiàn)，往往會推動科研學(xué)術(shù)界發(fā)現(xiàn)新的biomarker（生物標志物），疾病診斷的參考依據(jù)也會更加多樣化和精準，整個IVD市場蛋糕也會被做大。
除了準確度靈敏度，免疫檢測還有重要突破點，那就是多重檢測。
常規(guī)免疫檢測，都是單指標檢測，也就一個測試只能檢測一個指標。這種效率非常低，設(shè)備檢測通量基本受制于機械機構(gòu)設(shè)計。流式熒光法和數(shù)碼液相芯片的出現(xiàn)能大大提高檢測通量：
1. 流式熒光法，典型代表是美國Luminex，2000年就嶄露頭角了，作為平臺型技術(shù)，可以開發(fā)免疫和分子相關(guān)的檢測指標。在免疫方面，通過編碼微球技術(shù)，Luminex可以最多同時檢測100個指標，120樣本/h的處理速度，可以達到12000測試/h的檢測通量。
2. 數(shù)碼液相芯片技術(shù)，典型代表是美國Applied Biocode，將半導(dǎo)體光刻技術(shù)應(yīng)用到IVD領(lǐng)域，通過光刻法將12位二進制數(shù)字條碼刻到磁珠上（上圖所示），這種工藝可以制備出4096種（212=4096）不同編碼的數(shù)碼磁珠，每種編碼也就意味著一種指標，而且可以同時檢測免疫和分子指標。?免疫學(xué)診斷技術(shù)在感染性疾病的使用已經(jīng)很普遍了，因為操作相對簡便，日常檢測比核酸手段更加常見，例如常說的術(shù)前八項（HBV HCV HIV TP），還有其他呼吸道感染病原體（流感 肺支 肺衣 合胞 腺病毒等），通過檢測抗體或抗體即可進行初步診斷。?實驗室診斷技術(shù)包括免疫診斷的發(fā)展方向，主要在兩個：
1. 自動化：所有手工或半自動設(shè)備，將往自動化方向發(fā)展，例如分子診斷，然后實現(xiàn)流水線作業(yè)，并最終實現(xiàn)全實驗室自動化（total laboratory automation，TLA）和無人化。該方向業(yè)內(nèi)有些專家提出了質(zhì)疑，TLA會不會反而降低部分指標TAT；還有人提出“水果籃理論”，會不會因為利益關(guān)系，而降低了實驗室整體的質(zhì)量。
2. 便捷小型化：例如血氣或微型化學(xué)發(fā)光或分子POCT，實現(xiàn)POCT全場景即時檢測，脫離中心實驗。首要是便捷，其次才是體積，POCT核心并不是小，而是便捷，這是常見的誤區(qū)。?
這兩個方向存在的問題：
1. 自動化方向，人口增長及老年化帶來的樣本量急劇增高，醫(yī)院大樓不可能一直擴建，實驗室空間也很難繼續(xù)擴大，在實驗室設(shè)備人滿為患的當(dāng)下，加之很多產(chǎn)品（例如生化儀器、化學(xué)發(fā)光分析儀）的單通道檢測通量已經(jīng)達到極限，如何滿足未來檢測量的需求，怎么進一步提高實驗室的通量，已經(jīng)成為擺在檢驗界同行面前的一個現(xiàn)實問題。
2. 小型化方向，設(shè)備小型化最常用的開發(fā)思路就是將大型設(shè)備的功能或參數(shù)下調(diào)，例如減少樣本位和試劑位、降低溫控系統(tǒng)的體積、減少運動部件使用，甚至在操作自動化、性能指標上降低要求，看似達到了小型化目的，但也帶來了客戶操作體驗或產(chǎn)品性能的下滑，這是絕對不可取的，而且不要忽視了POCT產(chǎn)品本身也有通量需求。出現(xiàn)以上問題，原因在于機械結(jié)構(gòu)設(shè)計的局限性，而要解決這個問題，必須要重新思考技術(shù)實現(xiàn)形式，幸運的是，新的技術(shù)實現(xiàn)形式涌現(xiàn)出來，其中以微流控技術(shù)為主要代表。
鑒于以上思考，筆者認為，這種兩極分化的發(fā)展方向，在本質(zhì)上是一致的：在保證性能的前提下，提高實驗室單位空間（或者單位占地面積）的通量。
同時，筆者提出2個關(guān)鍵指標：博德致遠系數(shù)B（比通量）=T/V，博德致遠系數(shù)B2（坪效）=T/S，T為通量throughput，V為空間volume，S為占地面積square，這是業(yè)內(nèi)首次提出該概念。
??3、質(zhì)譜技術(shù)
質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）技術(shù)是一種譜學(xué)分析方法，它是通過制備、分離、檢測氣相離子來推測、鑒定和定量分析化合物的一門技術(shù)，核心原理是不同質(zhì)量的離子具有不同的質(zhì)荷比（m/z），在磁場和電場中，離子發(fā)生速度色散和質(zhì)量分離。所謂譜學(xué)分析，除了質(zhì)譜，還有光譜、色譜和波譜。
質(zhì)譜技術(shù)，可以根據(jù)離子源和質(zhì)量分析器來進行組合分類。
離子源主要有：電子電離EI、化學(xué)電離源（Chemical Ionization，CI）、快原子轟擊（FAB）、電噴霧（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI）等，后面兩個促進了質(zhì)譜在生物大分子分析領(lǐng)域的應(yīng)用，2002年J.B.Penn和田中耕一因ESI質(zhì)譜和MALDI質(zhì)譜獲諾貝爾化學(xué)獎。
質(zhì)量分析器主要有：四極桿Quad、離子阱ionTrap、飛行時間TOF、雙聚焦、傅立葉變換。
另外，質(zhì)譜技術(shù)常需要搭配色譜技術(shù)，本質(zhì)上是一種層析技術(shù)，利用不同樣品與固定相和流動相之間的相對移動力差別，在兩相中進行多次平衡，從而達到對樣品的相互分離。
常用色譜主要有：（1）氣相色譜GC（2）液相色譜LC或高效液相色譜HPLC（3）毛細管電泳CE（4）超臨界流體色譜SFC等等。根據(jù)色譜和質(zhì)量分析器也能對質(zhì)譜技術(shù)進行組合分類，例如：LC-MS、GC-MS等。
質(zhì)譜在臨床上的應(yīng)用，主要有：新生兒遺傳代謝疾病篩查、藥物濃度檢測、維生素檢測、激素類檢測、腫瘤標志物篩選、微生物鑒定和核酸分析等。其中基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of -flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）目前越來越多用于微生物鑒定和核酸分析工作。該技術(shù)對樣品純度要求不高，可以直接使用臨床樣本，或者經(jīng)過分離培養(yǎng)挑選單菌落進行檢測，獲得其蛋白質(zhì)譜圖，與更新的微生物數(shù)據(jù)庫參考圖譜進行比對，從而鑒定至屬、種、乃至亞種的水平，縮短了鑒定的時間。對臨床常見的隱球菌鑒定，MALDI-TOF MS也表現(xiàn)了極好的鑒定能力。
臨床質(zhì)譜的發(fā)展方向，筆者個人認為：（1）進一步降低質(zhì)譜設(shè)備成本（2）提高自動化程度和降低實驗室條件要求（3）提高檢測通量（4）方法學(xué)需要標準化（5）加強微生物數(shù)據(jù)庫建設(shè)
?4、核酸檢測?
核酸檢測，包括核酸分子雜交、核酸擴增技術(shù)、基因芯片、測序技術(shù)等技術(shù)。利用核酸檢測感染性疾病中的病原體微生物已經(jīng)在臨床、疾控、環(huán)境等領(lǐng)域廣泛使用，任何生物（朊病毒除外，這是一個奇葩特例）都含有特異的核酸，通過核酸分析技術(shù)，可以直接得出樣品中微生物的存在。
其中核酸分子雜交包括膜上印記扎染、熒光原位雜交、芯片雜交、RNA酶保護分析法、核酸酶S1保護分析。
核酸擴增技術(shù)，按照擴增反應(yīng)溫度是否變化，分為PCR變溫擴增技術(shù)和恒溫擴增技術(shù)。其中，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)根據(jù)定性或定量能力分為：普通PCR定性技術(shù)、熒光qPCR定量技術(shù)和數(shù)字dPCR絕對定量技術(shù)。
PCR技術(shù)的發(fā)明絕對是人類生物學(xué)研究的一大里程碑事件，直接促成了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，僅次于沃森和克里克對DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)，DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)是直接開創(chuàng)了分子生物學(xué)。
這樣一個godkiller技術(shù)的發(fā)明過程也是頗具傳奇色彩：1983年嗑藥后飆車的老司機Kary Mullis大神在幻覺下爆發(fā)出來的靈感，最終通過實驗嘗試并證明可行性。PCR專利一經(jīng)公布，并火遍全球，對人類分子生物學(xué)的研究起到了極大推動作用。（這個PCR專利建議每一個從事生物研究的人都學(xué)習(xí)下）。關(guān)于PCR技術(shù)的進一步發(fā)展，筆者還想提下另一位大神，美國猶他大學(xué)的Carl Wittwer教授，后面會介紹他的貢獻。
PCR屬于底層原理技術(shù)，專利壁壘極高，根本無法繞開。同時，PCR技術(shù)需要經(jīng)過變性、退火和延伸三個步驟，三個步驟均在不同溫度下進行（見上圖，后來經(jīng)過酶改造，退火和延伸的溫度可以統(tǒng)一），溫度控制要求也就比較高?；谝陨显颍ㄖ饕€是專利原因），就有學(xué)者們發(fā)明了與PCR這種變溫核酸擴增技術(shù)相對應(yīng)的恒溫擴增技術(shù)（Isothermal amplificationtechnology，IAT）。
恒溫擴增技術(shù)也有各種流派，常見的有：LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、RPA重組酶聚合酶擴增（有公司也叫RAA技術(shù)）、RCA滾環(huán)擴增、SDA酶促DNA體外等溫擴增方法、CRP交叉引物恒溫擴增技術(shù)、TMA轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)核酸擴增、NASBA基于核酸序列擴增、SAT實時熒光恒溫擴增檢測等等。
另外，還需要提及一種技術(shù)，branch DNA信號放大技術(shù)（見上圖）。PCR和IAT技術(shù)都是將核酸進行擴增，通過染料或探針的信號增強來提高核酸檢測靈敏度，而branchDNA技術(shù)不將核酸進行擴增，而是直接通過將單靶標分子的信號直接放大，無需抽提純化RNA，無需反轉(zhuǎn)錄，無需PCR擴增，只要將樣本用特定裂解液裂解后，經(jīng)探針雜交與信號放大后即可迅速得到基因定量結(jié)果。
基因芯片是利用基因微陣列技術(shù)，將特異的寡核苷酸片段以高密度排列在片基上，與目的片段進行識別和雜交，通過特定的檢測系統(tǒng)和分析系統(tǒng)進行結(jié)果解讀，可實現(xiàn)多靶標多種病原體微生物的同時檢測。
測序技術(shù)根據(jù)先進程度分為一代測序（sanger測序）、二代測序（即NGS，illumina和Thermo為主的高通量大規(guī)模平行測序）、三代測序（PacBio公司的SMRT、Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術(shù)），在讀長上，三代測序可以達到幾十kb，遠超二代測序技術(shù)，未來潛力巨大。
NGS用于感染性疾病是最近幾年興起的，因為測序會測出樣本中所有的微生物，而不是像PCR那樣單一靶標，所以被稱為mNGS（meta-genomicsNGS）宏基因組學(xué)分析，這項技術(shù)最大的優(yōu)勢是解決PCR檢測靶標相對單一的問題，可以檢出未知病原體。
在此，讓我們來回顧下mNGS技術(shù)在本次新冠疫情中的使用。
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基因編輯技術(shù)是近些年異常火爆的生物技術(shù)，尤其是經(jīng)過南方科大賀建奎胚胎編輯事件后，為社會大眾廣泛認知。
基因編輯技術(shù)主要由兩位大神發(fā)現(xiàn)：麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)Broad研究所張鋒研究員、加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna教授。
這兩位大神后來分別成立了Sherlock Biosciences和Mammoth Biosciences公司，利用基因編輯技術(shù)，通過gRNA靶向和Cas酶的定向剪切，實現(xiàn)核酸靶向檢測，可在試紙條上顯色直接肉眼觀測，在第三世界國家傳染病防控和治療上有一定價值。
具體實驗操作，以張鋒團隊新冠病毒檢測試劑盒為例：
大致步驟就是：RNA提取純化、RPA擴增、Cas13酶切、顯色判別。未來有可能做到免提取，只需要一個恒溫水浴鍋即可，這樣才能真正滿足第三世界的條件要求。?
5、四種技術(shù)在感染性疾病診斷中的使用比較
筆者先為大家鼓個掌，你們能堅持看到這里，一定程度說明了你們對技術(shù)的熱愛和好奇。同時，大家心里可能也一直有個疑問，這些技術(shù)之間有什么差別，我應(yīng)該怎么選擇呢？
從多方面綜合考慮，核酸檢測是最優(yōu)方案，培養(yǎng)是最普及方案，免疫學(xué)和質(zhì)譜可作為輔助手段聯(lián)合使用。
?6、不同核酸分析技術(shù)的比較
核酸檢測（即分子診斷）在感染性疾病的診斷中，經(jīng)過分析是最優(yōu)方案，一旦解決了核酸檢測現(xiàn)狀，就會全面普及，市場開始爆發(fā)。但是核酸檢測的不同技術(shù)也有差別，請看下表。
筆者認為，每種技術(shù)均有優(yōu)勢與局限性，所以使用場景的選擇和市場定位就顯得尤為重要。
常規(guī)操作PCR是最優(yōu)選項，IAT因為性能問題可以作為備選方案，可用于寵物醫(yī)療和食品環(huán)境檢測；基因芯片有一定價值，但開發(fā)難度、成本和性能上還需要提高；mNGS使用場景相對受限，屬于ICU危重癥病人采用PCR有限病原體排查后仍然無法確診的最后方案。
?7、核酸分析未來的發(fā)展方向
?筆者認為，PCR作為最成熟的分子診斷技術(shù)，還有很廣闊的開發(fā)空間，伴隨精準診斷的意識覺醒，分子診斷市場將迎來爆發(fā)增長。
上圖是筆者關(guān)于診斷技術(shù)與產(chǎn)品的發(fā)展方向的判斷，一家之言，現(xiàn)對各方面逐一講解。
1. 全自動和全集成：現(xiàn)有市場上的PCR儀器，本質(zhì)上是一個精密溫控和光學(xué)檢測設(shè)備，而PCR儀器檢測的核酸樣品，還需要經(jīng)過上游的樣本裂解處理和核酸提取純化過程。傳統(tǒng)PCR實驗操作，分別在四個獨立實驗室內(nèi)部操作，以防止樣本間的核酸污染，見下圖。
全集成是指四步操作能在一臺設(shè)備內(nèi)全部完成，而全自動是指能在一臺設(shè)備內(nèi)完全自動完成，中間無需人工操作或干預(yù)。
IVD其他領(lǐng)域全自動都已經(jīng)實現(xiàn)，例如血球、凝血、生化、免疫等，唯獨分子診斷因為技術(shù)門檻還未完全實現(xiàn)和普及。市面上已經(jīng)出現(xiàn)了兩種全自動解決方案：全自動核酸一體化分析工作站、全自動微流控核酸分析系統(tǒng)。
全自動核酸工作站，不同于其他IVD全自動設(shè)備，核酸分析因為過于靈敏，對樣本交叉污染和氣溶膠污染是零容忍的，所以除了高難度的機械結(jié)構(gòu)設(shè)計，還對氣流控制和模塊封閉性有很高的要求，這進一步加大了研發(fā)門檻。另外工作站的采購成本也很高，也限制了醫(yī)院的使用。當(dāng)然這種產(chǎn)品在疾病爆發(fā)階段（例如本次新冠疫情）能發(fā)揮更大的作用。
另一種解決方案——全自動微流控核酸分析系統(tǒng)——則能更好的滿足當(dāng)下的醫(yī)院檢測需求，利用先進的微納制造技術(shù)，將PCR實驗每一步操作集成在微流控裝置內(nèi)（產(chǎn)品形式有：芯片、卡盒、離心盤），實現(xiàn)全自動一體化核酸分析。?2. 全封閉：如果能做到全自動和全集成操作，核酸如果能全流程在一個封閉體系內(nèi)，無需開蓋，樣本不會與空氣有任何接觸，這樣才會真正解決樣本間的核酸污染和氣溶膠問題。這方面目前只有微流控技術(shù)能實現(xiàn)，微流控技術(shù)將試劑各組分內(nèi)置在芯片或卡盒內(nèi)部，操作時，僅需將樣本加入到微流控芯片或卡盒預(yù)設(shè)的加樣孔，然后封閉加樣孔、上機檢測即可。?3. 快速：PCR需要通過控制溫度來實現(xiàn)核酸變性、退火和延伸步驟，三個步驟為一個循環(huán)（cycle），結(jié)束后核酸數(shù)量放大一倍（即擴增一倍），通常PCR反應(yīng)需要30~40個cycle。目前常規(guī)PCR擴增耗時一般需要1~2小時，快的能達到30min，這只是擴增檢測步驟，還不包括前面的樣本處理和提取。
PCR擴增速度與溫控模塊的升降溫速度和精度有很大關(guān)系，而升降溫速度和精度與PCR反應(yīng)體系的體積也成負相關(guān)，PCR反應(yīng)體積越小，升降溫能更快，精度更高。
目前全球PCR研究結(jié)果顯示，PCR能實現(xiàn)最快0.4s/cycle，20s內(nèi)完成整個PCR反應(yīng)，這個成果由世界知名PCR專家美國University of Utah大學(xué)Carl.Wittwer教授發(fā)明。Carl Wittwer教授同時是羅氏LightCycle、Biofire Filmarray、快速PCR、極限PCR、熔解分析、HRM分析的發(fā)明人，他對PCR技術(shù)的發(fā)展可以說僅次于PCR技術(shù)發(fā)明人Kary Mullis，是筆者最為欽佩的人之一。
微流控技術(shù)因為反應(yīng)體系小，從而可以實現(xiàn)更快的擴增速度。
?4. 多重和超多重：多重檢測是指一個反應(yīng)體系內(nèi)能同時擴增檢測的靶標數(shù)量。對于感染性疾病，因為我們并不知道病人感染了哪種病原體，如果采用傳統(tǒng)單靶標PCR試劑盒，每次只能檢測一種靶標，若檢測為陰性，則需要更換檢測其他靶標的PCR試劑盒，這樣效率就大大降低，異常盲目，俗稱“大海撈針”。要做到更快確診、鑒別診斷和排除診斷，就要設(shè)計多重檢測技術(shù)。
據(jù)統(tǒng)計，90%感染性疾病基本由50種左右病原體微生物導(dǎo)致，所以檢測50個靶標能解決臨床診斷的大部分問題，省下的10%就交給mNGS，這也是從衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)上來考慮的。?5. 高通量：除了以上要求，檢測設(shè)備在樣本檢測通量上也應(yīng)該有一定要求，來滿足醫(yī)院日益增加的核酸檢測需求。
