核酸檢測(cè)是新型冠狀病毒肺炎確診的重要手段。為了解我國新型冠狀病毒（2019?nCoV）核酸檢測(cè)的開展現(xiàn)狀及質(zhì)量狀況，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心（以下簡稱“臨檢中心”）于2020?年?3?月?16?日~24?日開展了?2019?nCoV?核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，并將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

本次臨檢中心下發(fā)了12個(gè)質(zhì)評(píng)樣本，均為國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心制備，為基因工程方法制備的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本，無生物傳染危險(xiǎn)性，其濃度采用數(shù)字PCR定量而來，樣本相關(guān)的信息如下：

全國返回855個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果

本次共計(jì)?1296?家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名，考慮到物流郵寄、自建方法信息的完整性等

因素，實(shí)際接受報(bào)名實(shí)驗(yàn)室數(shù)共計(jì)?889?家，包括疾病預(yù)防控制中心、二級(jí)或三級(jí)公立醫(yī)療機(jī)構(gòu)（含綜合醫(yī)院、專科醫(yī)療機(jī)構(gòu)、婦幼保健機(jī)構(gòu)）、獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室、海關(guān)所屬國際旅行衛(wèi)生保健中心、試劑研發(fā)廠家、科研院所等，共覆蓋全國?31?個(gè)省份（含自治區(qū)、直轄市），。

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本次共計(jì)收到?855?家實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，其中有效結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室數(shù)為?844?家（即回報(bào)結(jié)果完整、在截止日期內(nèi)回報(bào)的結(jié)果），采用單試劑檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室?759?家，

采用兩種或兩種以上試劑檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室?85?家，不同試劑檢測(cè)結(jié)果?931?份。

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評(píng)價(jià)原則和結(jié)果

“新型冠狀病毒核酸檢測(cè)”室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的評(píng)價(jià)原則如下：

（1）假陰性結(jié)果：500?個(gè)copies/mL?以上濃度的?2019-nCoV?樣本均要求檢出，?包括202002、202004、202008?和?202011，未檢出為假陰性結(jié)果。

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（2）假陽性結(jié)果：2019-nCoV?陰性樣本，包括其它冠狀病毒陽性樣本，均應(yīng)報(bào)告?2019-nCoV?陰性。報(bào)告?2019-nCoV?陽性為假陽性結(jié)果。

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（3）PT?成績計(jì)算：?202010?號(hào)樣本不計(jì)分。

202001、202002、202004、202005、202006、202007、202008、202011、202012號(hào)樣本均要求與?2019-nCoV?預(yù)期結(jié)果相符，完全相符判定為實(shí)驗(yàn)室為合格；否則，為不合格。采用兩種試劑檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，以最終結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)室成績是否合格（不單獨(dú)評(píng)價(jià)各試劑檢測(cè)結(jié)果）。

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（4）質(zhì)評(píng)結(jié)果：本次質(zhì)評(píng)中，共計(jì)收到?844?家實(shí)驗(yàn)室的有效結(jié)果（即回報(bào)結(jié)果完整、在截止日期內(nèi)回報(bào)的結(jié)果），其中合格實(shí)驗(yàn)室?701 ?家（83.1%），不合格實(shí)驗(yàn)室?143

家（16.9%）。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)

（1）?各樣本總體符合率和復(fù)檢率

（2）各實(shí)驗(yàn)室使用的方法學(xué)差異

使用方法包括包括實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR、PCR-基因芯片、PCR-飛行時(shí)間質(zhì)譜、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增、數(shù)字 PCR 和高通量測(cè)序方法（包括宏基因組測(cè)序）。但是實(shí)驗(yàn)室基本上都使用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法，其它方法由于回報(bào)結(jié)果少，100%符合也不能說明該方法具有優(yōu)越性。

注：核酸檢測(cè)的假陽性通常由于標(biāo)本間交叉污染和實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物遺留污染，但也可能是由特定試劑引物探針本身的特異性問題所致。

（3）各廠家產(chǎn)品差異

不同試劑對(duì) 202011、202008、202004 和 202002 號(hào)陽性樣本的符合率和復(fù)檢率見表 6，202010 號(hào)樣本（128 copies/mL）共計(jì) 6 家實(shí)驗(yàn)室檢出，2 家為圣湘生物、2 家為達(dá)安基因、2 家為自建方法（實(shí)時(shí)熒光 PCR、數(shù)字 PCR 法各 1 家）。

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核酸檢測(cè)試劑：97.5%（908/931）的回報(bào)結(jié)果使用實(shí)時(shí)熒光 PCR 法，各試劑的分析敏感性存在差異。NMPA 批準(zhǔn)的試劑各陽性樣本（8×10?4?copies/mL，?1.6×10?4copies/mL,?3.2×10?3?copies/mL,?640?copies/mL）檢測(cè)的符合率總體好于使用自建方法的實(shí)驗(yàn)室。

• 陽性樣本檢測(cè)結(jié)果的符合率和復(fù)檢率

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• 不同品牌的試劑各靶基因檢出率

各試劑不同靶區(qū)域的敏感性也存在差異。本次質(zhì)評(píng)樣本為?ORF?區(qū)和?N?區(qū)連接在一起的病毒樣顆粒，因此?ORF?和?N?區(qū)的數(shù)量是完全一致的，但是試劑對(duì)兩個(gè)區(qū)域檢測(cè)的陽性率差異明顯。以回報(bào)結(jié)果數(shù)>10?份的試劑來看，總的來說，N?區(qū)的陽性率高于?ORF?區(qū)，樣本越弱，這一現(xiàn)象越顯著。

目前各試劑有單靶標(biāo)、雙靶標(biāo)和三靶標(biāo)檢測(cè)的方式，在疫情初期臨床病例數(shù)不足，方法設(shè)計(jì)尚無法進(jìn)行充分的驗(yàn)證。但是在現(xiàn)階段，試劑廠家應(yīng)該已有一定數(shù)量的臨床數(shù)據(jù)，用來論證一些方法設(shè)計(jì)的依據(jù)是否科學(xué)。

比如，要求兩個(gè)靶基因同時(shí)陽性，那么單個(gè)靶基因陽性的樣本，其中假陽性的比例有多少？造成假陽性的原因是什么？單靶標(biāo)陽性必須要復(fù)檢一致，才能判定陽性，那么如果不復(fù)檢，會(huì)造成假陽性的比例有多少？造成假陽性的原因是什么？雙靶標(biāo)或者三靶標(biāo)檢測(cè)的作用，主要是為了提高檢測(cè)的敏感性還是特異性？是否存在多引物探針之間的競爭或者干擾？單靶標(biāo)陽性的原因是什么？

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本次“?全國新型冠狀病毒核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)”?主要評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室對(duì)2019-nCoV?核酸檢測(cè)的能力，重點(diǎn)考察實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的分析性能，包括分析敏感性和分析特異性。

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室間質(zhì)評(píng)采用基因工程方法建立的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本（本實(shí)驗(yàn)室制備），無生物傳染危險(xiǎn)性。該樣本適用于?NMPA?批準(zhǔn)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑，19?種未批準(zhǔn)的商品化試劑和?32?家不同實(shí)驗(yàn)室自建方法。

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本次質(zhì)評(píng)，共計(jì)?844?家實(shí)驗(yàn)室回報(bào)有效結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室總體檢測(cè)情況良好，合

格實(shí)驗(yàn)室?701?家（83.1%）。同時(shí)也反映出一些問題，具體如下。

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• 假陰性結(jié)果

本次質(zhì)評(píng)含有?5?份陽性樣本，分別為8×10?4??copies/mL，1.6×10?4??copies/mL,3.2?×10?3?copies/mL,?640?copies/mL?和128?copies/mL。臨床研究表明，呼吸道和非呼吸道樣本中新型冠狀病毒載量平均為3.21×10?4??copies/mL（2.21×10?2~4.71×10?5

copies/mL），呼吸道樣本中新型冠狀病毒載量平均4.33×10?4??copies/mL。

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另一研究表明，痰液樣本濃度較高（中位數(shù)?7.52?× 10??copies/mL），咽拭子樣本濃度較低（中位數(shù)?7.99?× 10??copies/mL）。由于能獲取痰液的患者有限，臨床上鼻咽拭子采樣更為普遍。因此，本質(zhì)評(píng)樣本基本符合臨床樣本中病毒載量的情況。

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本次質(zhì)評(píng)要求實(shí)驗(yàn)室能夠檢出8×10?4?copies/mL，1.6×10?4?copies/mL,?3.2×10?3copies/mL, 640 copies/mL?四個(gè)濃度水平的樣本。各臨床實(shí)驗(yàn)室在?1.6×10?4?copies/mL?以上濃度水平，符合率均可以達(dá)到97%以上，主要的問題存在于對(duì)3.2×10?3?copies/mL?和?640 copies/mL?兩個(gè)弱陽性樣本檢出能力。導(dǎo)致檢測(cè)假陰性的原因涉及核酸提取和檢測(cè)兩個(gè)過程。

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盡管實(shí)驗(yàn)室一般會(huì)很關(guān)注檢測(cè)試劑的性能，但實(shí)際上核酸提取試劑的質(zhì)量??也是檢測(cè)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本次質(zhì)評(píng)中實(shí)驗(yàn)室使用的核酸提取方法包括手工-柱提取法、手工-磁珠提取法、自動(dòng)化儀器-柱提取法、自動(dòng)化儀器-磁珠提取法和一步法等，各實(shí)驗(yàn)室使用的核酸提取試劑種類超過 40 種，各檢測(cè)試劑均存在與多個(gè)核酸提取試劑搭配使用的情況。

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核酸檢測(cè)從提取到完成擴(kuò)增檢測(cè)是一個(gè)體系，但是如此多的核酸提取試劑，各種不同的操作程序，各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)體系實(shí)際上并不相同。因此，即使采用同一核酸檢測(cè)試劑，但由于核酸提取試劑的不同，檢測(cè)的分析敏感性也必然會(huì)存在差異。

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相同核酸提取純化試劑，各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)程序也有所不同。使用“中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司核酸檢測(cè)試劑”的 224 家實(shí)驗(yàn)室，58 家使用配套的“達(dá)安基因核酸提取純化試劑”，各實(shí)驗(yàn)室使用的核酸提取的樣本量均為 200μL ，但洗脫體積包括 40、50、60、80、90 和 100μL 等。

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實(shí)驗(yàn)室方面：各實(shí)驗(yàn)室人員提取的操作能力存在差異，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室所有陽性樣本均未檢出。造成這一結(jié)果的主要原因，很可能是人員操作的問題，當(dāng)然也不排除核酸提取試劑某一批次質(zhì)量存在問題的可能性。部分實(shí)驗(yàn)室盡管檢出陽性樣本，但是從報(bào)告的 Ct 值來看，實(shí)際上也存在較大差異。

一些實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)過程中缺乏質(zhì)量控制及對(duì)單靶標(biāo)陽性樣本解讀的能力不足，這部分實(shí)驗(yàn)室多開展臨床檢測(cè)時(shí)間不長，或者地區(qū)流行率低，日常檢出陽性樣本數(shù)極少。甚至使用相同試劑的實(shí)驗(yàn)室對(duì)單靶標(biāo)的處理方式也不同。

• 假陽性結(jié)果

從質(zhì)評(píng)結(jié)果來看，假陽性率較低，出現(xiàn) 2 例或 2 例以上假陽性的實(shí)驗(yàn)室共 7 家（0.8%，7/844）。實(shí)驗(yàn)室污染（擴(kuò)增產(chǎn)物遺留污染和標(biāo)本間交叉污染）在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室存在。部分試劑存在和其它冠狀病毒的交叉反應(yīng)。

綜上所述，我國目前臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì) 2019-nCoV 核酸檢測(cè)能力較強(qiáng)，同時(shí)也存在需要改進(jìn)的方面，建議各試劑廠家根據(jù)目前臨床應(yīng)用情況，總結(jié)臨床性能的數(shù)據(jù)；自建方法應(yīng)加強(qiáng)對(duì)試劑性能的評(píng)價(jià)；臨床實(shí)驗(yàn)室在開展檢測(cè)前或更換試劑批號(hào)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，以發(fā)現(xiàn)不同試劑批號(hào)存在的差異以及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力；臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用參與核酸提取過程的弱陽性樣本和多份（如 3 份） 陰性樣本，進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，以有效監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)弱陽性樣本的檢測(cè)能力和實(shí)驗(yàn)室污染；臨床實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果解讀能力的人員培訓(xùn)。

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參考資料：臨檢中心《全國新型冠狀病毒核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果報(bào)告》。

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